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细胞原代培养实验-胰酶消化法浏览数:2085次
细胞原代培养可以：（1）为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段；（2）为传代培养创造条件；（3）服务于临床实践，用于药物筛选等。 实验方法原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。 实验材料 胎鼠 新生鼠 试剂、试剂盒 1640培养基 牛血清 胰酶 Hank’s液 碘酒 仪器、耗材 培养箱 培养瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 纱布 手术器械 血球计数板 离心机 水浴箱 实验步骤 一、实验材料准备 1. Hank’s液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。 1. 将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。二、具体操作 2. 用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 3. 用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。 4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 6. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 7. 1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。 8. 加入Hank’s液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9. 加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 注意事项 1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 4. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 7. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 9. 吸溶液的吸管等不能混用。
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