细胞培养中细胞污染的鉴别

细胞培养过程中如果操作不当或者条件控制不合适见容易受到化学或者生物因素的污染，常见的污染源有：　

1、细菌污染

　　细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。

　　培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。

2、真菌污染

　　真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

　　培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。

　　真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

3、支原体污染

　　支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。

　　培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。

4、病毒污染

　　组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。

尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

5、非同种细胞污染

　　由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

   在发现培养的细胞出现生长异常时需要对细胞的污染情况进行鉴别，以利于采取补救措施。常见的污染鉴别方法如下：

　　1、细菌、真菌污染的检测

　　（1）肉眼观察

　　细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。

　　（3）接种观察

　　采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。

　　（2）镜下观察

　　在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。

　　若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

　　2、支原体污染的检测

　　（1）相差显微镜观察

　　直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。

　　应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。

　　（2）荧光染色法观察

　　用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。

　　 （3）电镜检测

　　若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

　　（4）培养检测

　　将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

　　3 、病毒的检测

　　1) 应用电镜技术快速诊断动物病毒病

　　冠状病毒电镜图：

　　2) 逆转录_聚合酶链反应RT_PCR检测病毒