细胞冻存与复苏技术

概述

细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。

低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0～196℃进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20～40℃ 冰箱保存、-60～80℃深低温冰箱和液氮（-196℃）超低温保存等。

应用方向

1. 医学方面

近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。

根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。

骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。

而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。

2. 生物学方面

细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。

发展历史

1. 1776年，Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。

2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者（Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870）重复研究了低温处理对******活动的影响，得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死******”。

3. 1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。

4. 二十世纪50年代，Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。

5. 1972年，Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。

这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤（Intracellular ice damage）。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。

同时随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤（Solution damage）。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。

主要技术

冻存技术

1. 液氮法

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。

细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（121℃蒸气高压消毒），2ml安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。

主要操作步骤为：

（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min，10分钟）。

（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/ml之间。

（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5ml在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。

（4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。

2. 分布降温法

细胞系冻存程序：

1) 单层细胞的消化。将经24～48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液，加适量ATV，1～2分钟后倒弃ATV，再加入少量ATV液，经0.5～1分钟倒去ATV，室温或37oC温箱作用2～3分钟，视细胞解离情况，拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2/0瘤细胞，待生长好后用吸管吹打，再经1000转/分离心l0分钟。

2) 离心洗涤：向培养瓶内加5～10m1预冷的MEM使细胞悬浮，再将其吸出置灭菌离心管中，以1000rpm 离心8～10分钟后弃去上清液。

3) 细胞悬液的制备：向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液，使细胞浓度为150~400万/ml，然后迅速分装于安瓿瓶中，每瓶加量为lml。

4) 致冷冻结：将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内，直立置不同条件下致冷冻结果保存：

a. 4℃两小时后移至-20℃作用2小时，再移入-40℃4小时后在-70℃下24小时投入液氮。

b. -20℃4小时后移至-40℃，经4小时移人-70℃冰箱24小时，投入液氮。

c. -40℃4小时后移入-70℃24小时后投入液氮。

d. -20℃4小时后移入-70℃经24小时后投入液氮中。

e. -70℃24小时后投入液氮中。

5) 液氮中保存：将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中，投入液氮。为防止安瓿漂浮，可预先在小布袋中加入几块小卵石。

3. 玻璃化法

玻璃化保存（Vitrification）是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤，可获得较高存活率。

玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列．并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡，而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列，这就是冰冻死亡的原因。玻璃化比冻结固化方法引起的结构变化要小，因而是一种较理想的低温保存途径。

1981年，Fahy首先明确提出，用高浓度的低温保护剂溶液，可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化，以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”，使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。

1985年，Rail和Fahy用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功，是这种技术走向实用化的首次突破。

复苏技术

1. 细胞复苏的原则

在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

2. 细胞复苏的主要操作步骤

（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

（2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。

（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。

3. 注意事项

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

技术总结要点

1. 冷冻速度

冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。

不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩．超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。冷冻速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。

不同细胞的最适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。一般来说，小细胞（如红细胞等）对水通透性强，适用于快冻，最佳冷冻速率较高，可达103℃/min或更高；相反大的细胞或组织，如直径100nm以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。此外，最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温，一般认为降温速率以1～5 ℃/min为最佳。

2. 冷冻保存温度

冷冻保存温度是指长久保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止。经过长期保存的细胞和组织在复苏后仍能保存正常的结构和功能。

冷冻保存温度可以随着不同的细胞和生物体以及不同的冷冻保存方法而不同。液氮温度（-196 ℃）是目前最佳冷冻保存温度。在-196 ℃时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。应用-70～-80 ℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在0～40℃范围内保存细胞效果不佳。

3. 复苏

复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也需要有最佳的复温速度，这样才能保证最终得最佳冷冻保存效果。与冷冻过程相比，复温过程的研究显得薄弱得多。

复温速度不当同样会造成细胞损伤，降低冻存细胞存活率。其损伤发生非常快，持续时间也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通过对酵母细胞的冷冻研究发现，冷冻过程中胞内形成的冰晶并未对细胞造成致命的损伤，反而是在复温过程中，复温到-40℃或者更高的温度时，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞的致命损伤。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温，也就是通常采用的快速复苏。因此，最佳复温速率与最佳冷冻速率对保证获得最佳冻存效果同等重要。

4. 冻存保护剂

冻存保护剂（Cryoprotectant）是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质（常为溶液）。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成．同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞，在常温下对细胞有害。故在细胞复温后要及时清除冷冻保护剂。